Comment cela soutient un projet
Un plan de marquage doit définir molécule cible, sites réactifs, marqueur, stœchiométrie, purification et essai confirmant que le matériau marqué conserve sa fonction.
Séparer conjugaison et performance de la sonde
Esters NHS, maléimides, paires azide-cyclooctyne et tétrazine-TCO diffèrent en sélectivité, conditions, cinétique, stabilité, encombrement et hétérogénéité. Les groupes disponibles et le contrôle de site requis déterminent la réaction.
Une liaison covalente ne prouve pas l’aptitude à l’imagerie ou à l’analyse. Degré et distribution du marquage, marqueur libre, agrégation, liaison, signal, bruit de fond et stabilité doivent être mesurés. Des études sur anticorps montrent qu’une charge accrue peut réduire la fraction active.
Flux type de marquage
Définir cible et lecture
Préciser protéine, peptide, oligonucléotide, lipide, polymère, particule ou surface et essai prévu.
Cartographier les sites
Relever amines, thiols, azides, alcynes, cyclooctynes, tétrazines, TCO, tags ou résidus introduits et positions critiques.
Choisir marqueur et paire
Définir dye, biotine, tag d’affinité, chélateur ou autre marqueur exact et l’adapter aux conditions.
Fixer la stœchiométrie
Définir degré ou occupation souhaité et tester une plage d’équivalents; la charge maximale n’est pas toujours optimale.
Conjuguer et purifier
Contrôler ordre, arrêt de réactioning, retrait du marqueur libre, échange de tampon, lumière et groupes sensibles.
Caractériser la sonde finale
Mesurer identité, pureté, ratio et distribution, marqueur libre, agrégation, signal, liaison ou fonction et stabilité.
Informations requises avant la sélection
Molécule cible
Identité ou structure, concentration, quantité, formulation, groupes et sensibilité au pH, solvant, température, métal ou lumière.
Site et stœchiométrie
Stratégie aléatoire ou spécifique, nombre souhaité, positions à protéger et hétérogénéité acceptable.
Marqueur
Fluorophore, biotine, fonction réactive d’affinité, chélateur ou marqueur exact; excitation et émission seules ne suffisent pas.
Contraintes de réaction et purification
Tampons, additifs, solvant, concentration, température, durée, méthode et formulation finale.
Critères d’acceptation
Ratio, pureté, limite de marqueur libre, fonction conservée, signal/bruit et stabilité.
Périmètre de cette page
Cette page couvre fonctions réactives réactifs, réactifs avec segment espaceur, intermédiaires prêts pour dye ou biotine et précurseurs sur mesure. Elle n’affirme ni rendement, spécificité de site, degré de marquage, fluorescence, conservation de liaison, résolution, usage diagnostique, aptitude in vivo, sécurité ou statut réglementaire.
Catalogue et pages techniques associés
Sources
- 1.A strain-promoted [3 + 2] azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems (Journal of the American Chemical Society, 2004)
- 2.Tetrazine ligation: fast bioconjugation based on inverse-electron-demand Diels-Alder reactivity (Journal of the American Chemical Society, 2008)
- 3.Fluorescent-labeled antibodies: Balancing functionality and degree of labeling (Analytical Biochemistry, 2010)
- 4.Site-Specific Fluorescent Labeling of Hemagglutinin-Specific Antigen Binding Fragment through Amine Chemistry Revealed by Mass Spectrometry (Analytical Chemistry, 2023)